発見は、CRISPR-Cas9遺伝子編集の精度を改善するのに役立ちます

Anonim

カリフォルニア大学バークレー校とマサチューセッツ総合病院の科学者は、CRISPR-Cas9が標的DNA配列上でどの程度正確に位置するかを制御するCas9タンパク質内の重要な領域を同定し、それを微調整して、今日までのオフターゲットの最低レベル。

研究者らは、DNA切断のマスターコントローラーとして同定されたタンパク質ドメインは、精度をさらに向上させるためにリエンジニアリングの明確な標的である、と研究者らは述べている。 このアプローチは、科学者がCRISPR-Cas9が間違った場所でDNAを編集する可能性を最小限に抑えるために、DNAに結合して切断するタンパク質であるCas9の変異体をカスタマイズするのに役立つはずである。

改善された精度を達成するための戦略の1つは、REC3と呼ばれる支配的なタンパク質領域に突然変異を作り、どの標的がオンターゲット切断の効率に影響を与えずに精度を改善するかを見ることです。

我々は、Cas9のREC3ドメインのわずかな改変でさえ、オンターゲットとオフターゲットの編集の差異に影響を与えることを見出した。これは、このドメインが、標的特異性を改善するための詳細な突然変異誘発の明らかな候補であることを示唆する。 CRISPR-Cas9遺伝子編集ツールを共同発明したJennifer Doudna研究室の大学院生であるJanice Chen氏は、REC3の中で、我々が作った標的突然変異よりも、 。

共同創設者のChen、Yavuz Dagdas、Benjamin Kleinstiver、UCバークレー、マサチューセッツ総合病院、ハーバード大学の同僚らは、 Nature 誌に掲載される前に、今日オンラインで結果を報告しています。

超高精度Cas9

2012年、分子細胞生物学教授のDoudnaとUC BerkeleyのHoward Hughes Medical Instituteの研究者、Max Planck Institute of Infection BiologyのEmmanuelle Charpentierが、Cas9タンパク質を安価で正確かつ容易に作成するために再利用した研究者はオフターゲット編集の機会を減らそうと努力してきた。 改善された忠実度は基本的な研究に有益ですが、臨床応用のために遺伝子を編集する場合、オフターゲットのDNA切断は重要な遺伝子を無効にし、予期せぬ恒久的な副作用を引き起こす可能性があるため、

この2年間で、2つのチームが、正確なCas9タンパク質を設計しました。これは、eSpCas9(1.1)と呼ばれる高度な特異性と、SpCas9-HF1と呼ばれる忠実度の高いもので、ChenとDoudnaは野生よりも特異性が高い理由を学びました現在で広く使用されているストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9タンパク質である。

現在、CRISPR-Cas9を使用している研究者は、標的とする特定の20核酸DNA配列を補完する20のリボ核酸の鎖を含むRNA分子であり、それをCas9に結合する単一ガイドRNA(sgRNA)を作製する。 このガイドRNAは、Cas9が相補的なDNAを取り込んでそれに結合し、二本鎖らせんを切断することを可能にする。 しかし、Cas9-sgRNA複合体は、正確には一致しないDNAにも結合することができ、望ましくないオフターゲット切断を招く。

2015年にDoudnaの研究室はRNAガイドとDNA標的が一致すると活性化されるCas9のコンフォメーションスイッチを発見しました。 彼らは、Cas9の3次元構造、特にHNHヌクレアーゼドメインの立体配座が密接に一致する場合にのみ、Cas9のはさみを変化させ活性化させることを発見した。 しかしながら、コンホメーションスイッチの上流の核酸を検出する原因となるプロセスは未知のままであった。

現在の研究では、ChenおよびDagdasは、Cas9-sgRNAタンパク質複合体(特にREC3、REC2およびHNH)の様々なタンパク質ドメインが、複合体が結合したときにどのように動くかを正確に測定するために、単一分子FRET(Forster共鳴エネルギー移動) DNAに結合する。

彼らは、最初に、eSpCas9(1.1)およびSpCas9-HF1によって与えられる特異性の利点が、HNHコンフォメーションスイッチの閾値が野生型Cas9タンパク質の場合よりもこれらのCas9変異体の方がずっと高く、eSpCas9 (1.1)およびSpCas9-HF1変異体は、オフターゲット配列に結合した場合にハサミを活性化する可能性が低い。

次に、彼らは、REC3ドメインが標的結合の正確さを感知することに関与していることを明らかにした。これはREC2ドメインの外向き回転をシグナルしてHNHヌクレアーゼドメインの経路を開き、はさみを活性化する。 Cas9のこの活性コンフォメーションは、標的DNAの両方の鎖を切断することができる。

Chen、DagdasおよびKleinstiverは、REC3の一部を変異させることにより、Cas9タンパク質の特異性を変化させ、HNHヌクレアーゼがガイドRNAと標的DNAの一致が非常に近いものでなければ活性化しないことを示した。 HypaCas9と呼ばれる改良された超高精度Cas9をエンジニアリングすることができましたが、それは標的効率を保持しますが、ヒト細胞のオンターゲットとオフターゲットの差を識別するのにやや優れています。

「REC3の特定のアミノ酸残基を突然変異させると、Cas9の標的となる活性と特異性が改善されたバランスを微調整することができ、目的の標的に十分な活性があるだけでなく、目標のイベントとなる」と述べた。

Doudnaとそのチームは、Cas9の構造、機能、ダイナミクスの関係を引き続き探求することにより、様々な遺伝子改変を確実かつ効率的に行うための絶妙な感度でタンパク質をさらに設計することを望んでいます。

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